翠绿瞬间黑化的镍柱毁容惨案：为什么 His-tag 纯化蛋白绝不能加高浓度 DTT？

每个在蛋白纯化室摸爬滚打过的研究生，几乎都目睹过这幕令人魂飞魄散的“毁容惨剧”：为了防止含有半胱氨酸的目的蛋白氧化聚集沉淀，好心往细胞裂解液里豪横倒入了 5 mM 二硫苏糖醇（DTT），结果液体刚顺着塑料层析柱滴进那层饱满翠绿的 Ni-NTA（镍琼脂糖凝胶）填料，整根柱子在一秒钟内从青翠欲滴的森林绿瞬间暴变成酱油般的焦黑与灰褐色！

这背后的配位化学原理极度暴烈：Ni-NTA 是瑞典乌普萨拉大学 Porath 于 1975 年提出的金属螯合亲和层析（IMAC），通过四齿配体次氮基三乙酸将带两个正电荷的二价绿色镍离子（$ext{Ni}^{2+}$）固定住，利用剩余的两个空轨道与多聚组氨酸（6×His）咪唑环配位。

而 DTT 拥有两个邻近的双巯基，被氧化时能自发脱氢形成极其稳定的六元环状二硫化物，具有极其强大的负还原电位（$-0.33 ext{ V}$）。当它遇到镍柱时，强悍的电子直接强行塞给二价镍，将其不可逆地还原成了毫无结合能力且细小脱落的零价金属镍单质（$ext{Ni}^0$）！

整根价值上千的昂贵层析柱当场报废毁容。若纯化必须还原，只能换用没有游离硫醇、不还原过渡金属离子的膦类还原剂 TCEP。