开启分子克隆黄金时代的大肠杆菌质粒蓝图：pBR322 与双抗性筛选
1977 年 6月10日 · pBR322 经典质粒载体、氨苄青霉素与四环素抗生素双抗平板
你知道吗？
四千三百六十一个碱基构筑的微小环形迷宫，用两道抗生素抗性基因的生杀开关，定义了整整两代分子克隆人手中的第一把瑞士军刀。
每一个学过分子生物学的人，在教材“质粒载体”那一章的第一幅插图上，见到的永远是那个由一圈同心圆构成的质粒祖师爷——pBR322。在 1970 年代中期，科学家做克隆用的都是天然野生大肠杆菌质粒（如 ColE1、pSC101），分子量巨大、拷贝数低得可怜，而且上面几乎没有几个好用的限制性内切酶切点，每做一次重组都像在原始森林里开荒。
在 UCSF 赫伯特·博耶实验室里，来自墨西哥的两位青年博士后弗朗西斯科·玻利瓦尔（Francisco Bolivar）与雷蒙多·罗德里格斯（Ray Rodriguez）决心人工攒一台“极简克隆跑车”。1977 年 6 月他们正式发表了由两人名字缩写命名的质粒 pBR322（全长 4361 碱基对）。
这个质粒的设计堪称工业美学的巅峰：它精心敲除了所有非必需冗余片段，塞入了高拷贝的 pMB1 复制起始位点（ori），更塞入了两个互为备份的抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性（） 与 四环素抗性（）！
更神的是，常用的 BamHI 和 SalI 酶切位点被巧夺天工地下在了四环素基因的正中间；一旦外源 DNA 插入成功，四环素抗性瞬间“插入失活（Insertional Inactivation）”，实验员只需用丝绒布影印涂布两块平板，看哪群菌落能在氨苄板上活着、在四环素板上死掉，就能百分之百挑出阳性克隆！