三种酶在50度温水里组团干活：Gibson无缝克隆如何终结“找酶切位点”的噩梦？
2009 年 3月12日 · 无缝克隆试剂盒 (Gibson Assembly / ClonExpress)
你知道吗？
利用T5外切酶在50摄氏度下的“定时自杀”，Gibson让啃末端、补缺口与封口三道工序在同一滴水里完成了无缝交接。
十多年前做分子克隆的师兄师姐，最怕的噩梦就是“目的基因内部到处都是酶切位点”——为了把一个3 kb的片段塞进载体，你得对着酶切图谱眼花缭乱地排查几十种限制性内切酶，还要担心留下的6个碱基“酶切疤痕（Scar）”破坏阅读框。
如今，无论你用的是NEB的Gibson Assembly还是国产诺唯赞的ClonExpress同源重组试剂盒，只需要在引物5'端挂上15到20个碱基的载体同源臂，PCR跑出来混进50℃温水孵育15分钟，哪怕三四个片段也能严丝合缝地拼成环，连半个多余碱基都不留！
这项颠覆传统的神技由克雷格·文特尔研究所的Daniel G. Gibson于2009年3月在《Nature Methods》正式发表，最初是为了拼装世界上第一个人工合成生命——蕈状支原体基因组。它的原理是一场极其默契的“三酶50℃接力赛”：第一步，怕热的T5核酸外切酶先从DNA片段的5'端往里啃，露出3'单链悬垂尾巴，让带有相同序列的载体和片段精准退火搭桥；更绝的是，在50℃高温下，不耐热的T5外切酶啃着啃着就自己热变性“殉职”了，绝不会把DNA啃穿！
第二步，耐高温的Phusion DNA聚合酶顺着搭好的桥把缺口补齐；第三步，同样耐高温的Taq DNA连接酶咔嚓一封口，全程一管到底，行云流水。