活体细胞里的无缝自愈术：绍斯塔克与酵母缺口修复同源重组克隆
1981 年 10月1日 · 限制酶切线性化缺口酵母穿梭质粒、两端带同源重叠末端的 PCR 片段与醋酸锂转化液
你知道吗？
生命最本能的欲望是愈合伤口，聪明的工程师只需在伤口间夹带私货。
当体外分子克隆还在受困于T4连接酶的低效率时，杰克·绍斯塔克与特里·奥尔-韦弗在1981年发现了一个大自然早已演化成熟的“活体无缝克隆机”。与大肠杆菌视线性DNA如毒蝎不同，酿酒酵母内部拥有一套狂暴而精准的同源重组双链断裂修复系统（DSBR）。
研究人员用限制酶在酵母穿梭质粒上切出一个巨大的物理缺口，导致质粒彻底线性化丧失自主环化能力；随后，他们仅仅把带有该缺口两侧数十个碱基同源序列的外源DNA片段，与这个残疾的开环载体一同用醋酸锂转化法送入酵母细胞。在进入细胞核的瞬间，酵母的重组雷达被强烈激活：它不仅没有降解外源线性片段，反而将其作为最完美的同源修复模板，通过单链侵入、链置换以及高保真延伸，把外源基因严丝合缝地织进了载体缺口中，自发重组为完整的闭环功能质粒！
这种“缺口修复克隆（Gap Repair Cloning）”完全抛弃了体外连接步骤，让酵母成为日后人工合成支原体全基因组乃至合成酵母基因组（Sc2.0）的终极造物工厂。