吃掉单边留下一把阶梯：亨尼科夫外切核酸酶 III 单向巢式缺失术

在20世纪80年代，虽然双脱氧测序法已经问世，但毛细管电泳尚未诞生，一块变性大胶一次测序的最大极限读长只有300至400个碱基。如果手里有一段长达数千碱基的未知克隆基因，测序引物在读完前几百个碱基后就会撞上茫茫“未知区”，测序陷入彻底停滞。

1984年史蒂文·亨尼科夫利用外切核酸酶III（Exo III）极其刁钻的立体构象识别特性，发明了惊艳学界的“分子切土机”巢式缺失法。Exo III只专一性地从DNA双链的平末端或5'突出端向内逐个啃食3'端核苷酸，但当遇到4个碱基的3'突出端（如PstI或SacI酶切位点）时，酶活口袋发生严重空间位阻，水解被彻底死死卡住！

亨尼科夫在载体多克隆位点分别用两种酶切割，制造出外侧抗性端和内侧敏感端，随后在37°C水浴加入Exo III。伴随着定时器的每分钟嘀嗒声，研究者每隔60秒吸取几微升反应液扔进含有S1核酸酶的冰冷试管中猝灭并剪平单链。伴随时间推移，基因片段被像切香肠一样均一削短，瞬间生成一整套步进重叠的巢式克隆，彻底扫平了超长基因盲测的鸿沟。